Created by Kamila Klavíková
Nukleáza je enzym hydrolyzující fosfodiesterovou vazbu nukleových kyselin. Štěpí chromozomovou DNA ve specifických místech, čímž spouštějí systém pro opravu rozštěpené DNA a způsobují tak genovou modifikaci.
TALEN a ZF jsou domény polypeptidů schopné se specificky vázat na nukleotidy DNA.
Fokl je doména endonukleázy schopná navodit zlom v DNA.
zinc finger nuclease,zinkové prsty
Zinkové prsty se skládají ze dvou domén, jedna se váže na DNA pomocí zinkových prstů a druhá obsahuje nukleázovou doménu odvozenou z Fok1 restrikčního enzymu. Zinkové prsty rozeznávají trinukleotidy. Pro plnou funkci jsou zapotřebí dvě molekuly této nukleázy, protože Fok1 funguje jako dimer. Upravené domény je možné řetězit, aby rozeznávaly delší specifickou sekvenci (obvykle 9-18 nukleotidů) Nevýhodami omezená délka vkládané sekvence, obtížnost návrnutí jednotlivé funkční ZFN a jednotlivé ZF domény se mohou navzájem ovlivňovat.
CRISPR-Cas9, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
Tato metoda využívá RNA pro pozměnění DNA. Pomocí guide RNA (gRNA) najde specifický úsek na šroubovici DNA. Aktivuje se komplex Cas9. Dojde k rozstřižení DNA a spuštění opravných mechanismů. Je nutné dodat bakteriální plasmidy se sekvencí pro enzym Cas9. Systém pochází z bakterie, kde je součástí imunity pro fágové infekci.
TALE nukleázy, Transcription Activator-Like Efector Nuclease
TALE nukleázy jsou podobné zinkovým prstům. Také obsahují dvé domény, z nichž jedna je odvozená z Fok1 restrikčního enzymu, ale používají místo zinkových prstů TALE domény. Každá TALE doména rozeznává jednu bázi ve velkém žlábku. Takže tyto nuklázy je možné použít na jakoukoli cílovou sekvenci.
Dvouřetězcová RNA je rozpoznána enzymem Dicer, který ji naštěpí na menší fragmenty (small interfering RNA, siRNA), následně zpracované komplexem RISC (RNA-Induced Silencing Complex). Tento komplex porovnává sekvenci siRNA a sekvence různých mediátorových RNA (mRNA) v buňce. Pokud najde shodu, odpovídající mRNA je degradována, čímž se zabrání tvorbě proteinů.
